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뇌병리 프로토콜
표본 제작 8단계
각 단계를 클릭 시, 해당 내용을 바로 보실 수 있습니다.
1단계 : 고정 (fixation)
목적
- ① 자가융해방지
- ② 조직 내 화학물질의 용해 및 소실 방지
- ③ 미생물에 의한 부패방지
- ④ 조직손상의 방지
- ⑤ 염색에 대한 매염작용
고정제 : 10% 포르말린 고정액 이용
고정시간
- 일반적인 작은 동물(mouse) 조직의 경우 12~24시간
- 큰 동물 및 인체뇌조직 경우 1주 이상 소요
- ※ 신청자의 요청 시 고정시간 변경 가능
2단계 : 수세 (washing)
흐르는 물을 이용
목적
고정액과 formalin pigment를 제거
3단계 : 탈수 (dehydration) / 투명 (clearing) / 침투 (infiltration)
탈수 (dehydration)
목적
조직내에 있는 수분 제거
탈수제 : alcohol
과정
70%→80%→90%→95%→100%→100% alcohol 점진적 대체
투명 (clearing)
목적
탈수제(alcohol)를 제거하여 조직성분이 침투제(paraffin)를 받아드리게 하는 역할
투명제 : xylene
침투 (infiltration)
목적
세포와 세포 사이의 공간에 지지체를 형성 → 박절 시 조직이나 세포의 구조가 변형되지 않음
침투제 : paraffin
4단계 : 포매 (embedding)
목적
조직을 박절하기 위해 일정한 모양의 paraffin block을 제작
필요장비 : 자동포매센터
paraffin block 제작 과정
- 1단계
조직 크기에 맞는 mold 선정 - 2단계
mold 내 액체 paraffin 1차 분주 - 3단계
조직 병변 부위 및 박절 부위를 확인하여 안착 - 4단계
조직이 움직이지 않도록 mold 바닥부위에 있는 paraffin을 굳힘 - 5단계
cassette 결합 - 6단계
액체 paraffin 2차 분주 - 7단계
Cold plate에서 paraffin 고체화 - 8단계
Mold와 cassette 분리
5단계 : 삭정 (trimming)
목적
포매 후 박절에 적합하도록 카세트 주위에 굳어있는 파라핀을 제거하는 과정
삭정 전
삭정 후
6단계 : 박절 (cutting)
목적
조직 내부구조를 정확히 현미경으로 관찰하기 위해 paraffin block을 얇게 자르는 과정
필요장비 : 박절기, 냉각판, 부유항온수조
박절기
냉각판
부유항온수조
미염색 슬라이드 제작 과정
- 1단계
Paraffin block 냉각 - 2단계
장비 설정 (두께 설정) - 3단계
Blade와 Paraffin block을 각 holder에 결합 - 4단계
박절 (연속절편 생성) - 5단계
연속절편을 1차로 수조에 띄운 후 절편 선택 및 슬라이드에 부착 - 6단계
부착된 슬라이드 내 절편을 부유항온수조에 2차로 띄움 - 7단계
잔주름 제거 확인 뒤 최종 슬라이드에 부착 - 8단계
미염색 슬라이드 완성 및 슬라이드 라벨링
Paraffin block의 박절 시 결함의 원인
- 구부러지며 똑바로 나오지 않는 절편
- 칼날의 예리한 정도가 일정하지 않다.
(한 쪽은 무디고 다른 쪽은 예리하다.) - 칼과 block이 평행하지 않다.
- 칼과 block의 온도가 높다.
- 칼날의 예리한 정도가 일정하지 않다.
- 조직이 뜯기거나 부스러지는 절편
- 탈수, 투명과정이 불완전하다.
- Paraffin의 crystal artifact가 유발되었다.
(포매, 침투 시 65℃ 이상으로 paraffin을 오래 방치했을 경우) - 조직 내부에 질긴 섬유성 조직이 들어 있다.
- 상처가 나며 수직으로 갈라지는 절편
- 칼에 흠이 나 있다.
- 칼 끝에 이물질이 묻어 있다.
- 조직 내부에 부분적인 석회화나 이물질이 들어 있다.
- 두꺼웠다 얇아졌다 하는 절편
- 칼과 block이 헐겁게 조여져 있다.
- 깍이는 조직 내부의 경도가 상이하다.
- Block이 너무 크다.
7단계 : 염색 (staining)
목적
생체나 고정상태의 세포는 그 구성성분 및 세포간 물질이 투명하기 때문에 검경 시 각 세포 구성 성분의 구별을 가시화 하기 위함
염색 과정(hematoxylin&eosin) : 1)탈paraffin 2)함수 3)염색 4)탈수 및 투명
- 1) 탈 paraffin : 조직 내부에 침투된 paraffin과 조직 외부에 포매된 paraffin을 제거
- 60℃ oven 혹은 신전기 – 30min
- 실온 – 10min
- xylene - 5min
- xylene - 5min
- 2) 함수 : 고농도의 alcohol에서 저농도의 alcohol을 단계적으로 거친 다음 수세하는 과정
- 100% alcohol – 1분
- 100% alcohol – 1분
- 95% alcohol – 1분
- 85% alcohol – 1분
- 75% alcohol – 1분
- 수세 – 1분
- Xylene
- 함수
- 3) 염색(Hematoxylin & Eosin)
- ① Hematoxylin : 핵 염색
- ② 1% Hcl-alcohol : 염색된 세포질의 Hematoxylin 제거
- ③ ammonia water : 핵의 청색화(중화)
- ④ Eosin : 세포질 염색
- hematoxylin – 5분
- 수세 - 1분
- 1% Hcl-alcohol – 1dip
- 수세 - 1분
- ammonia water – 5dip
- 수세 – 1분
- Eosin – 2분
- 4) 탈수 및 투명 : 조직 내부에 물과 알코올 제거
- 75% alcohol – 1분
- 85% alcohol – 1분
- 95% alcohol – 1분
- 100% alcohol – 1분
- 100% alcohol – 1분
- xylene - 5min
- xylene - 5min
- Hematoxylin
- 1% Hcl-alcohol Ammonia water
- Eosin 탈수 및 투명
H&E stain protocol
| 단계 | 염색 과정 | 시약 | 반응시간 |
|---|---|---|---|
| 1 | 탈 paraffin | xylene | 5 min |
| 2 | xylene | 5 min | |
| 3 | 함수 | 100% alcohol | 1 min |
| 4 | 100% alcohol | 1 min | |
| 5 | 95% alcohol | 1 min | |
| 6 | 85% alcohol | 1 min | |
| 7 | 75% alcohol | 1 min | |
| 8 | tap water | 1 min | |
| 9 | 염색 | Hematoxylin | 5 min |
| 10 | tap water | 1 min | |
| 11 | 1% Hcl-alcohol | 1 dip | |
| 12 | tap water | 1 min | |
| 13 | 0.5% ammonia water | 5 dip | |
| 14 | tap water | 1 min | |
| 15 | Eosin | 2 min | |
| 16 | 탈수 | 75% alcohol | 1 min |
| 17 | 80% alcohol | 1 min | |
| 18 | 95% alcohol | 1 min | |
| 19 | 100% alcohol | 1 min | |
| 20 | 100% alcohol | 1 min | |
| 21 | 투명 | xylene | 5 min |
| 22 | xylene | 5 min |
Gallyas silver stain protocol
| 단계 | 시약 | 반응시간 |
|---|---|---|
| 1 | 탈 paraffin 단계 | 16 min |
| 2 | D.W | 1 min |
| 3 | 5% periodic acid | 5 min |
| 4 | D.W | 5 min |
| 5 | D.W | 5 min |
| 6 | alkaline silver iodide | 1 min |
| 7 | 0.5% acetic acid | 10 min |
| 8 | developer sol. | 7 min |
| 9 | 0.5% acetic acid | 3 min |
| 10 | D.W | 5 min |
| 11 | 0.1% gold chloride | 5 min |
| 12 | D.W | 1 min |
| 13 | 1% sodium thiosulphate sol. | 5 min |
| 14 | D.W | 1 min |
| 15 | 0.1% nuclear fast red | 4 min |
| 16 | D.W | 1 min |
| 17 | 80% alcohol | 1 min |
| 18 | 95% alcohol | 1 min |
| 19 | 100% alcohol | 1 min |
| 20 | 100% alcohol | 1 min |
| 21 | xylene | 5 min |
| 22 | xylene | 5 min |
LFB-PAS(Luxol fast blus-Periodic acid-Schiff’s)
| 단계 | 시약 | 반응시간 |
|---|---|---|
| 1 | 탈 paraffin 단계 | 16 min |
| 2 | Luxol fast Blue | 6 hr 이상 |
| 3 | 95% alcohol | 1 min |
| 4 | tap water | 1 min |
| 5 | 0.05% lithium carbonate solution | 10~20 sec |
| 6 | 70% alcohol | 5~6 dip |
| 7 | tap water | 1 min |
| 8 | 0.5% Periodic acid | 10 min |
| 9 | tap water | 1 min |
| 10 | Schiff's reagent | 10 min |
| 11 | tap water | 5 min |
| 12 | Hematoxylin | 6 min |
| 13 | tap water | 1 min |
| 14 | 1% Hcl-alcohol | 2 dip |
| 15 | tap water | 1 min |
| 16 | 0.5% ammonia water | 5 dip |
| 17 | tap water | 1 min |
| 18 | 80% alcohol | 1 min |
| 19 | 95% alcohol | 1 min |
| 20 | 100% alcohol | 1 min |
| 21 | 100% alcohol | 1 min |
| 22 | xylene | 5 min |
| 23 | xylene | 5 min |
8단계 : 봉입(mounting)
목적
염색표본을 명확히 관찰하기 위해 slide와 굴절률이 유사한 점도가 높고 투명한 매질을 떨어뜨린 후 cover glass를 덮어 영구보존 하기 위함
비수용성 봉입제
Cover glass
